Este tipo de análisis es empleado usualmente para corroborar la presencia de compuestos por su masa molecular. Puede ser empleado para monitorear reacciones de síntesis químicas, determinar la pureza de estándares comerciales, entre otros. La precisión de masa es de <5 ppm (100-1000 Da).
Este tipo de procedimiento permite un análisis más detallado que la infusión directa, ya separa compuestos de mezclas usando la cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC) (Fase reversa; C18 y fenil-hexil, fase normal; HILIC). Esto permite determinar el número de compuestos presentes en mezclas y sus masas moleculares. Además, mediante el uso de la disociación inducida por colisión (del inglés, Collision-induced dissociation), las moléculas se fragmentan para obtener sus espectros de fragmentación (MS2) que al ser analizados por software de derreplicación permiten identificarlos mediante bases de datos. Nuestro laboratorio utiliza software de gran exactitud para la determinación de fórmulas químicas que no solo emplean la distribución isotópica como variable, sino que también emplean el MS2.
Ofrece las mismas características que el análisis de moléculas pequeñas. Se diferencia a un péptido de una proteína por el límite superior o cut-off de 2,500 Da.
Este análisis permite determinar la masa molecular de proteínas de hasta ~150 KDa, debido a las propiedades de la ionización por electroespray (ESI). Para la separación de proteínas puras, semipuras y en mezclas, se emplea la HPLC utilizando columnas de fase reversa C4. En ciertas condiciones, se pueden determinar las modificaciones postraduccionales presentes en la proteína de interés. La masa molecular promedio se reporta para proteínas mayores a 3 KDa, mientras que para moléculas más pequeñas se reporta la masa monoisotópica.
Este análisis es ideal para el descubrimiento de nuevas moléculas e identificación de moléculas ya conocidas en tipos de muestras que se enumeran a continuación:
El número de compuestos detectados por este método oscila entre los 1,000-3,0001 por muestra analizada debido a la gran velocidad de adquisición de datos MS1 y MS2 del AB Sciex TripleTOF 5600+2 que empleamos en el laboratorio. Nuestro personal cuenta con la experiencia en el empleo de distintos software novedosos (state-of-the-art) para el procesamiento de datos a gran escala1,3. Cuando se analizan más de dos grupos experimentales, podemos emplear análisis multivariantes (análisis de componentes principales [PCA] y de agrupación por variables [PCVG]), lo cual nos permite identificar compuestos de alta relevancia que pudiesen ejercer un papel de biomarcador en un grupo experimental. Por ejemplo, en el caso comparativo de dos o más extractos de productos naturales podemos identificar los metabolitos de mayor relevancia que diferencian a ambas muestras4.
Este análisis se emplea cuando se sabe el tipo de compuestos a detectar. Las masas exactas de los compuestos a detectar o cuantificar son seleccionadas en el detector del espectrómetro de masas para ser fragmentadas y generar los MS2. Esta aproximación mejora la precisión y exactitud en la cuantificación de los compuestos en estudio comparado con análisis no dirigidos. Un ejemplo de la utilidad de este análisis es cuando se propone cuantificar niveles de fármacos en plasma o suero que son transformados a varios metabolitos (2 o más). Otro ejemplo es la cuantificación de aminoácidos en extractos celulares, suero o plasma. Para esto, en una sola inyección de muestra al LC-MS se pueden cuantificar los varios compuestos.
Para la identificación de proteínas, empleamos el método bottom up en el cual las proteínas son enzimáticamente lisadas (usualmente tripsina) para generar péptidos que posteriormente serán caracterizados in silico y asignados a una proteína. Nuestro laboratorio se encarga de procesar la muestra (reducción, metilación y digestión) y el usuario debe colectar las proteínas en un buffer compatible con el espectrómetro de masas (sin detergentes Triton X-100, SDS, Tween-20, NP40, etc.) y cuantificar el contenido de proteína (p.ej. Bradford, BCA) en la muestra para evaluar si es óptima de ser analizada. Se requieren entre 5-10 µg de proteína total. Las soluciones pueden enviarse liofilizadas o en solución, congeladas al menos a -20 ºC; sin embargo, comuníquese con nosotros para planear el experimento.
Presenta el mismo principio que la identificación en solución con algunas diferencias. El procedimiento de la obtención de la banda en gel debe manejarse idealmente en una campana de flujo laminar y con extrema limpieza para evitar la contaminación de keratina en la muestra. Las bandas pueden provenir de geles 1-D y 2-D en poliacrilamida. El corte de la banda (1x1 a 2x2 mm por pedazo) debe contener la mínima cantidad de gel sin muestra. Se recomienda que el usuario optimice el método para que la tinción de la banda con azul de Coomassie (o SYPRO Ruby) sea visible, ya que esto resultará en una identificación más rápida y precisa de las proteínas de interés. La muestra puede enviarse en tubos eppendorf (polipropileno con baja unión a proteínas) de 1.5 o 2 ml en una solución con 1% ácido acético a 4 ºC. Se recomienda enviar una muestra extra del mismo gel empleado, pero sin proteína para evaluar contaminantes. Nuestro laboratorio procesará la muestra (reducción, metilación y digestión) para ser inyectada en el equipo LC-MS. Sin embargo, comuníquese con nosotros para planear el experimento.
Nuestro laboratorio se especializa en la cuantificación de proteínas por método SWATH en muestras de cultivos celulares, tejidos animales y clínicas de pacientes. La cuantificación de proteínas (sin fraccionamiento por LC) oscila entre 1,300 a 1,700. No obstante, mediante el uso de la bioinformática, podemos extender la cuantificación de proteínas a más de 2,000. Este tipo de análisis permite determinar diferencias en la abundancia de proteínas entre dos o más grupos con una alta exactitud y precisión. Ofrecemos también el análisis bioinformático de los datos. Es obligatorio planear los experimentos con nuestro laboratorio antes de enviar las muestras.
Aunque en esencia este método es similar al análisis metabolómico dirigido, se diferencia en que se crea un método de cuantificación usando estándares internos para mejorar la precisión y exactitud de la cuantificación. Además, hace referencia al análisis de muestras seriadas (distintos tiempos) en fluidos biológicos (sangre, orina, plasma, suero, etc.). Ofrecemos también el desarrollo y validación de métodos de este tipo.
Si se requiere mayor información comunicarse con el Dr. Aldo Moreno Ulloa amoreno@cicese.mx
